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單克隆抗體的細(xì)胞融合方法
點(diǎn)擊次數(shù):395 更新時間:2024-07-12

融合劑

細(xì)胞融合的方法有物理法,如電融合、激光融合,化學(xué)融合法和生物融合法,如滅活的仙臺病毒,此處例舉化學(xué)融合法中的一種即聚乙二醇融合法。聚乙二醇(PEG),在分子量為200~700時,呈無色、無臭的粘稠狀液體,分子量大于1000時,呈乳白色蠟狀固體,能溶于水、乙醇及其他許多有機(jī)溶劑,對熱穩(wěn)定,與許多化學(xué)藥品不起作用。用作細(xì)胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子量為4000者,常用濃度為50%,pH8.0~pH8.2(用10%NaHCO3調(diào)整),分子量小的PEG,融合效應(yīng)差,又有毒性,分子量過大,則粘性太大,不易操作。50%濃度,pH偏堿時融合效應(yīng)最高。也有采用30%~50%濃度的PEG加上10%二甲亞砜。不同批號的PEG,即使分子量相同,但融合率卻有明顯差異,選用時必須注意。每批都必須進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)后方可應(yīng)用。要買高純度的,一般選供氣相色譜用的PEG。

融合過程

融合的方法很多,常用的有轉(zhuǎn)動法和離心法。融合時脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的比例為1:1至10:1不等。3:1或5:1最為常用。

1.試劑與材料

(1)供融合用的脾細(xì)胞及骨髓瘤細(xì)胞。

(2)1640培養(yǎng)液100ml。

(3)完wan全1640液100ml。

(4)2.5%FCS-1640液50ml。

(5)HAT培養(yǎng)液100ml。

(6)50%PEG:取分子量4000,高純度的(日本進(jìn)口或Serva)PEG10g放入25ml瓶中高壓滅菌,使用前用預(yù)熱于40℃的1640液10ml等量(W/V)混合,以酚紅檢查pH,一般不必調(diào)pH。如pH有改變,可用HCl或NaHCO3調(diào)整。

(7)10ml和50ml的滅菌沉淀管或瓶。

(8)40孔塑料培養(yǎng)盤。

2.操作方法

⑴準(zhǔn)備好脾細(xì)胞。

⑵在50ml沉淀管中混合108脾細(xì)胞和107小鼠骨髓瘤細(xì)胞,并加入50ml2.5%FCS-1640液。

⑶室溫400g離心3min,使細(xì)胞沉淀。

⑷移去上清液。

⑸輕敲管底部,使沉淀流動,把沉淀管放于40℃水浴中,使其達(dá)融合溫度。

⑹加預(yù)熱至40℃的50%PEG0.8ml,用1ml吸管緩慢滴加,邊加邊搖沉淀管,肉眼觀察可見有顆粒出現(xiàn),滴加過程要求持續(xù)2min。

⑺加1ml1640液,邊加邊搖動,持續(xù)1min。

⑻重復(fù)⑺一次。

⑼加1ml1640液,邊加邊搖動,持續(xù)0.5min。

⑽重復(fù)⑼一次。

⑾加1640液15ml。

⑿室溫,400g離心1min,使細(xì)胞沉淀。

⒀去上清,輕敲管底部,加25ml含有HAT的wan全1640液。

⒁往已于前一日種有飼養(yǎng)細(xì)胞的40孔塑料培養(yǎng)盤中滴加融合的細(xì)胞液,每孔1滴(約0.05ml)。

⒂輕搖后,放入5%CO2飽和濕度的37℃溫箱中培育。

⒃第3、6、9、10日換入含HAT的wan全1640培養(yǎng)液。注意輕輕吸取上清液,勿將固定于孔底的細(xì)胞吸出,根據(jù)需要加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞。

⒄于第12、15日加入含有HAT的wan全1640培養(yǎng)液。在每次換液前用倒置顯微鏡觀察,大約在10天左右就可觀察到雜交瘤細(xì)胞生長出來。大多數(shù)雜交瘤細(xì)胞在10~20天內(nèi)出現(xiàn),但也有在1個月左右才能出現(xiàn)的。雜交瘤細(xì)胞出現(xiàn)后,吸取上清液,檢查抗體。

⒅對繼續(xù)生長的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行增殖傳代。在傳代過程中,依情況取消HAT液和wan全1640液而代之以10%FCS-1640液。同時保存于液氮和進(jìn)行克隆化,在這期間每代都要檢查抗體,以防止產(chǎn)生抗體細(xì)胞的變異和丟失。

細(xì)胞融合關(guān)鍵

1.技術(shù)上的誤差常常導(dǎo)致融合的失敗。例如,供者淋巴細(xì)胞沒有查到免疫應(yīng)答。這必然要失敗的。

2.融合試驗(yàn)最大的失敗原因是污染,融合成功的關(guān)鍵是提供一個無毒無菌的操作環(huán)境。

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